Štúdie a správy z konferencie Štátnej agentúry pre životné prostredie. Zväzok 49. Vplyv pesticídov na neresenie a larvy obojživelníkov

Štúdie a správy z konferencie Štátnej agentúry pre životné prostredie Zväzok 49 Vplyv pesticídov na neresenie a larvy obojživelníkov

Štúdie a správy z konferencie Zväzok 49 Vplyv pesticídov na neresenie a larvy obojživelníkov na príklade herbicídu (izoproturónu) a insekticídu (cypermetrínu)

5.1.2 Parametre vody 27 5.1.3 Obojživelné spektrum 27 5.2 Príjem látok označených 14 C 28 5.2.1 Príjem trení 28 5.2.1.1 Isoproturon 28 5.2.1.2 Cypermetrín 28 5.2.2 Kinetika absorpcie do lariev 29 5.2.2.1 Isoproturon 29 5.2.2.2 Cypermetrín 29 5.2.3 Isoproturonové metabolity 30 5.3 Toxicita 31 5.3.1 Miera násadových liahnutí a teratogenita 31 5.3.1.1 Isoproturon 31 5.3.1.2 α-cypermetrín 31 5.3.2 Poškodenie lariev 31 5.3.2.1 Isoproturon a komerčný produkt TOLKAN FLO 31 5.3.2.2 α-cypermetrín 32 5.3.3 Citlivosť určitých vývojových fáz 32 32.3.3.1 Isoproturon 32 5.3.3.2 α-cypermetrín 33 5.4 Biotransformácia 34 5.4.1 Isoproturon 34 5.4.1.1 Čistá účinná látka 34 5.4.1.2 Komerčné produkty 35 5.4.1.2. 1 TOLKAN FLO 35 5.4.1.2.2 FENIKAN 36 5.4.2 Cypermetrín 37 5.4.2.1 Účinné látky 37 5.4.2.1.1 Cypermetrín 37 5.4.2.1.2 α-cypermetrín 39 5.4.2.2 Komerčný produkt 40 5.4.2.2.1 FASTAC SC 40 6 Diskusia 41 6.1 Terénne štúdie 41 6.2 Požitie aktívnych zložiek pesticídov ffe 42 6.3 Toxicita 43 6.4 Biotransformácia 46 6.4.1 Isoproturon 46 6.4.2 Cypermethrin 49 6.5 Energetické hľadiská 51 6.6 Manažment 52 7 Závery 54 8 Literatúra 56 Publikácie I-IV 64 OBSAH 3

Obrázok 3: Chemická štruktúra 8 stereoizomérov cypermetrínu. a-cypermetrín je racemát dvoch boxovaných cis izomérov. Vyššie aplikačné dávky cypermetrínu (100 g/ha) napríklad viedli k tomu, že sa koncentrácia účinnej látky 100 ug/l merala 4 hodiny po postreku malými vodnými plochami vo vodnej hĺbke 2,5 - 10,0 cm (CROSSLAND, 1982). Ihneď po aplikácii bolo v extrémne tenkom povrchovom filme (0,05 mm) detegovaných 24 mg/l cypermetrínu, do týždňa hodnoty klesli na 50 µg/l. Počas prvej hodiny po suchozemskej aplikácii cypermetrínu na vinicu sa v susednej priekope priamo pod vodnou hladinou našlo 0,2 až 1,7 µg/l cypermetrínu (BENNETT et al., 1980). U populácií rýb a obojživelníkov z voľného výbehu sa nepozorovali žiadne abnormality správania alebo smrteľné účinky. ÚVOD 11

Obrázok 4: Možný prvý krok v metabolizme cypermetrínu štiepením esterovej väzby Existujú tiež náznaky biotransformácie cypermetrínu prostredníctvom konjugácie na glutatión (fáza II) po predchádzajúcej oxidácii cytochrómom P-450 závislými monooxygenázovými enzýmovými skupinami fázy I (DAVIES) a kol., 1994). Všadeprítomný GST je schopný katalyzovať konjugáciu na glutatión pre rôzne elektrofilné zložky, vrátane herbicídov a insekticídov (HAYES & WOLF, 1988; BUCCIARELLI et al., 1999; GLÄßGEN et al., 1999), čo demonštruje rozmanitosť Ilustrované izoenzýmy. Väčšina izoenzýmov GST je rozpustená v cytosóle (tzv.). GST viazaný na membránu (mgst) sa môže izolovať z pečeňového tkaniva rôznych cicavcov (napr. Potkanov; DEJONG et al., 1988) a tiež z pečene pazúrikovej žaby (SUN et al., 1998). Cytosolické izoenzýmy sú rozdelené do najmenej šiestich rôznych tried z dôvodu podobných aminokyselinových sekvencií a substrátových špecifík: a, u, π, θ, a σ (EATON & BAMMLER, 1999). V porovnaní s GST cicavcov je o obojživelníkoch známe pomerne málo (BUCCIARELLI et al., 1999). Predchádzajúce štúdie sa zameriavali na izoláciu a identifikáciu rôznych izoenzýmov GST u obojživelníkov (DI ILIO et al., 1992; GRUNDY & STOREY, 1998). Pre Bufo bufo bola popísaná zmena vzoru GST u obojživelníkov medzi embryonálnym štádiom a dospelým; niektoré izoenzýmy patriace do triedy π neskorších štádií vývoja (bbgst P2-2) sa javili ako účinnejšie proti toxickým účinkom reaktívnych metabolitov xenobiotík (BUCCIARELLI et al., 1999). Preto by sa v rámci rozsahu tejto práce mali skúmať účinky expozície pesticídom na aktivitu GST v rôznych vývojových štádiách obojživelníkov. 3.4 Testovacie organizmy Test FETAX (Frog Embryo Teratogenesis Assay-Xenopus Test; DAWSON & BANTLE, 1987) sa v súčasnosti používa ako štandardizovaný nástroj na skúmanie veľkého počtu biologických procesov v 14 ÚVOD

4 Materiál a metódy 4.1 Materiál 4.1.1 Vybavenie Vybavenie HPLC s 996 diódovým detektorom LiChrospher 100 RP-18 kolóna (250 x 4 mm; 5 µm) ochranná kolóna (4 x 4 mm) Spherisorb ODS kolóna (250 x 4,6 mm; 2), 5 µm) HPLC s scintilačným počítačom [14 C] ytritového skla Spintisorb ODSII kolóna (250 x 4,6 mm; 3 um) vodivostný meter ph-meter rotor 70,1 kyslíkový meter scintilačný počítač LSC 1900 TR scintilačný počítač 1409 Sep-Pak extrakčné kolóny spektrofotometer Uvikon 922 ultracentrifuga Optima Fotometer L-60 Fotometer PT-3 Výrobca Waters Merck Merck Sykam Shimadzu Berthold Merck WTW WTW Beckman WTW Packard Wallac Waters Kontron Beckman Macherey & Nagel Uvicon 4.1.2 Rádiochemikálie Chemický názov Špecifická aktivita Predaj 14C- IPU 3- (4-izopropyl- [14 C] -fenyl) - 3,965 MBq/mg medzinárodného izotopu 1,1-dimetylmočoviny Čistota> 97% Nemecko 14C-Cypermethrin R-kyano-3-fenoxybenzyl (1 R) - 4 625 MBq/mg medzinárodného izotopu cis-3 (2,2- dichlrovinyl) -2,2- čistota> 95% Nemecko dim etyl [14 C] cyklopropánkarboxylát 18 MATERIÁL A METÓDY

4.1.3 Chemikálie Chemický názov Predaj α-cypermetrín R-kyano-3-fenoxybenzyl (lR) -cis-3 (2,2-dichlórvinyl) - fluka 2,2-dimetylcyklopropánkarboxylát Bradfordovo činidlo Sigma Brij-35 polyoxyetylén lauryléter Fluka CaCl 2 chlorid vápenatý Merck CDNB 1-chlór-2,4-dinitrobenzén Fluka CH3CN acetonitril Roth CH3OH metanol Roth cypermetrin R-kyano-3-fenoxybenzyl (1 R) -cis-3 (2,2-dichlrovinyl) - fluka 2,2-dimetylcyklopropánkarboxylát DCNB 2,4-dichlór-1-nitrobenzén Fluka Diflufenikan Fluka DTE Ditioerytritol Sigma EDTA Kyselina etyléndiamíntetraoctová Sigma FASTAC SC BASF FENIKAN Bayer Fluorodifen 4-Nitrofenyl-2,2-nitrofluór-metylfenyléter Fluka Glycerol Sigma GSH izopropyl -1,1-dimetylmočovina Fluka morská soľ Aquarienhandel Na 2 HPO 4 hydrogenfosforečnan sodný Sigma NaH 2 PO 4 dihydrogenfosforečnan sodný Sigma NaHCO 3 hydrogenuhličitan sodný Merck NAP-10 Sephadex G-25 kolóny Amersham-Pharmacia TOLKAN FLO Bayer 4.1.4 Pufr na rozbitie tlmivého roztoku: tlmivý roztok fosforečnanu sodného r, 0,1 M, ph 6,5 mikrozómový pufor: tlmivý roztok fosforečnanu sodného, 20 mm, ph 7,0 20% glycerol 1,4 mm DTE 1 mm EDTA 20% glycerol 1,4 mm DTE cytosolový tlmivý roztok: tlmivý roztok fosforečnanu sodného, 20 mm, ph 7, 0 MATERIÁL A METÓDY 19

V priebehu kurzu obsah rádioaktívnej látky v larvách opäť významne poklesol, po 24 hodinách expozície dosiahol 59,12 ± 1,62 ng cypermetrínu/mg čerstvej hmotnosti, takmer hodnoty kontroly (53,65 ± 3,31 ng cypermetrínu/mg čerstvej hmotnosti) a zostali konštantné (obr. 10). U lariev R. arvalis bol zaznamenaný rýchly príjem a následná eliminácia 14C-značeného cypermetrínu. V eliminačnej fáze sa meral nárast obsahu rádioaktívne značených zlúčenín uhlíka v médiu, ktorým musí byť nekonvertovaný 14C-značený cypermetrín a/alebo jeho metabolity. 5.2.3 Metabolity izoproturónu Porovnaním retenčných časov 14 C-značených metabolitov B. bombina a B. variegata s pôvodnými štandardmi bolo možné u oboch druhov zistiť niekoľko metabolitov IPU, ako je napríklad N-demetylovaný derivát MDM-IPU, C-hydroxylované deriváty 1-OH-IPU, 2-OH-IPU, 1-OH-MDM-IPU a 2-OH-MDM-IPU a olefínový metabolit izopropenyl-IPU (obr. 11, publikácia I). Obrázok 11: Schéma metabolizmu izoproturónu podľa HAAS (1997) V tu prezentovanej štúdii boli detekované metabolity v rámčeku. 30 VÝSLEDKOV

8) Na obrábanie poľnohospodárskych plôch v centrách rozšírenia citlivých druhov obojživelníkov sú potrebné ekologickejšie výrobné postupy. Okrem uprednostňovania integrovanej ochrany proti škodcom a použitia technológie na znižovanie driftov sa odporúča vytvorenie zarastených ochranných pásov okolo vodného útvaru (s minimálnou šírkou 20 m). Agenda 2000 ponúka nástroje na vyplácanie kompenzácií v oblastiach postihnutých environmentálnymi obmedzeniami. ZÁVERY

Skratky 1-OH-IPU 1-Hydroxy-IPU 1-OH-MDM-IPU 1-Hydroxy-Monodesmetyl-IPU 2-OH-IPU 2-Hydroxy-IPU 2-OH-MDM-IPU 2-Hydroxy-Monodesmetyl-IPU B bombina Bombina bombina B. variegata Bombina variegata BCF biokoncentračný faktor BSA hovädzí sérový albumín, frakcia V CDNB 1-chlór-2,4-dinitrobenzén; Fotometrický substrát CP cytosolový pufor CPA kyselina cyklopropánkarboxylová DCNB 2,4-dichlór-1-nitrobenzén; Substrát fotometra DTE Ditioerytritol FFH Fauna-Flora-Habitat GSH Glutatión GST Glutatión S-transferáza HPLC Vysokotlaková kvapalinová chromatografia IPU Isoproturon kat Katal, jednotka pre enzýmovú aktivitu KO/W Rozdeľovací koeficient oktanol/voda MDM-IPU Monodesmetyl-IPU prenos mikrosomálnej glazúry Mikrozómový pufor NaP fosforečnan sodný tlmivý PBA kyselina fenoxybenzénová R. arvalis Rana arvalis takzvaný rozpustný glutatión S-transferáza 62 SKRATKY